Вирусологические исследования
Реакция коагглютинации (РКОА) основана на способности белка А золотистого стафилококка (штамм Cowan 1) соединяться с Fc-фрагментами lg человека. При этом Fab-фрагменты остаются свободными для реакции с гомологичными антигенами.
Основываясь на этом принципе, Мазанкова Л. Н. и Косоротико-ва А. И. внедрили в пpaктику тест твердофазной коагглютинации для индикации ротавирусного антигена в фекалиях больных. В качестве диагностикума использовали микробные клетки стафилококка, обработанные гипериммунной сывороткой против ротавируса обезьян (SA 11). Титр антигена определяли по наибольшему разведению, вызывающему коагглютинацию бактерий, покрытых антителами (на ++) на твердой фазе лунок панелей из полистирола.
Авторы установили специфичность теста при обследовании 410 детей в возрасте от 1 месяца до 14 лет, из которых у 84 (21%) идентифицирована ротавирусная инфекция (Мазанкова Л. Н., Косоротикова А. И., 1989).
Применение РКОА параллельно с ИФА и РАЛ показало близкую корреляцию результатов использованных методов (Zhang Y. et al., 1989 Pereira V. et al., 1992 Jap K. et al., 1992). Однако имеются сведения о появлении неспецифических реакций с копроматериалами, которые можно устранить предварительной адсорбцией взвесью стафилококков.
В то же время, несмотря на совпадение результатов обследования материалов РКОА и ИФА, чувствительность ее и специфичность оказалась ниже, чем у ИФА и сравнима с латекс-агглютинацией (Jap К. et al., 1992).
Таким образом, результаты применения РКОА позволяют рекомендовать ее для диагностики ротавирусной инфекции в лабораториях, где отсутствует возможность использования более чувствительных и специфичных методов. Однако апробированная в последнее время модификация РКОА и радиоиммунопреципитации с использованием белка А золотистого стафилококка позволила значительно повысить чувствительность и специфичность метода и изучить иммунологический ответ к VP2, VP6 и NSP2 в сыворотках и копроматериалах детей с RV инфекцией (Colomina I. et al., 1998).
Реакция агглютинации латекса (РАЛ) применяется в лабораторной пpaктике в связи с усилившейся в последние годы тенденцией использовать в качестве носителей антигенов и антител инертных синтетических материалов. С этой целью используют полистирольные латексы — синтетические глобулы со стандартным размером частиц около 0,8 мкм.
Более мелкие по размеру частицы (0,2-0,3 мкм) оседают в реакциях медленно и требуют ультрацентрифугации в процессе приготовления диагно-стикума, крупные же ( 1 мкм) часто дают неспецифические реакции. Частицы латекса, предварительно адсорбированные антителами (антигенами), приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологического антигена (антитела) и визуализируют специфический комплекс антиген-антитело.
С целью повышения специфичности и чувствительности метода латексные частицы могут быть сенсибилизированы иммуноглобулинами (Amer A. et al., 1990). В связи с простотой и скоростью проведения исследования, а также низкой стоимостью латекс-агглютинация используется в лабораторной пpaктике достаточно широко: Ruggeri F. et al., 1992.
В настоящее время налажен выпуск коммерческих тест-систем для латекс-агглютинации, что послужило основанием для проведения работ по сравнительной оценке их диагностической эффективности.
Обобщенные результаты оценки РЛА и других лабораторных методов обнаружили, что показатели чувствительности и специфичности РЛА по сравнению с ПЭМ, ИФА, ЭФ в ПААГ были достаточно высоки и равнялись 70-96% и 80-100% соот-ветствено (Santos N. et al., 1989 Molyneaux P. J. et al., 1989 Amer A. et al., 1990 Hendricks M. K. et al., 1995). Применение моноклональных антител еще более повышало диагностическую ценность РЛА (Dennehy Р. et al., 1988 Zbinden R. et al., 1992 Sanchez R. et al., 1993).
Наряду с коммерческими латекс-системами исследователи применяют и лабораторные тесты, которые дают сопоставимые с ними результаты (Amer A. et al., 1990).
В то же время ряд авторов указывали на то, что применение РЛА не лишено недостатков, так как дает определенное число ложных результатов. Так, при обследовании 200 больных детей методами ИФА и РЛА выявлено 11 ложнонегативных проб при показателях чувствительности и специфичности равных 86 и 95% соответственно (Amer A. et al., 1990).
Позднее другие авторы при обследовании 585 проб стула больных детей методом РЛА и ЭФ в ПААГ получили показатели чувствительности и специфичности равные 96 и 100% соответственно. При этом обнаружено 6 ложноотрицательных и 3 ложноположительных результата в отличие от ЭФ в nAAT.(Zbinden R. et al. 1992).
По данным Hendricks М. К. et al. обследование 103 детей в возрасте от 1 месяца до 5 лет методами ПЭМ, ЭФ в ПААГ и РЛА показало, что чувствительность этих методов равнялась 84, 90 и 80%, а специфичность 100, 100 и 81% соответственно. Авторы обнаружили 15% ложноположительных результатов по данным РЛА (Hendricks М. К. et al., 1995), что может быть связано при рота-вирусном гастроэнтерите с наличием крови в исследуемом материале.
В связи с этим при получении положительных реакций в РЛА с образцами, содержащими кровь, результаты следует интерпретировать с осторожностью и подтверждать другими методами (Bendall R. et al., 1991).
Таким образом, РЛА представляет собой наиболее простую диагностическую реакцию обнаружения ротавирусов. Являясь ценным методом экспресс-диагностики и обладая высокими показателями чувствительности и специфичности, этот метод, однако, не имеет никаких преимуществ перед ИФА, ПЭМ, ЭФ в ПААГ, кроме скорости проведения реакции, и нуждается в подтверждении другими методами.
Резюмируя материалы, следует отметить, что в целом осадочные тесты находят широкое применение в лабораторной диагностике ротавирусной инфекции в связи с высокой чувствительностью и скоростью получения результатов, простотой постановки и учета, а также отсутствием необходимости использования сложного оборудования и дорогостоящих реагентов.
Диагностические методы, основанные на выявлении вирус-специфических РНК. Разработка молекулярно-биологических методов в вирусологии привела к внедрению в пpaктику ряда новых диагностических тестов, основанных на выявлении вирусных РНК.
Их использование открыло возможность подхода к молекулярной эпидемиологии и позволило решить некоторые вопросы таксономии ротавирусов. Одним из первых диагностических методов этой группы стал электрофорез вирусного генома в геле.
Электрофорез вирусных РНК в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) достаточно универсален и широко распространен как в научно-исследовательских, так и пpaктических лабораториях. Благодаря своей высокой специфичности и чувствительности он позволяет решать целый комплекс проблем, связанных с ротавирусной инфекцией, и находит применение в диагностике, эпидемиологии и профилактике.
Возможность применения этого метода обусловлена уникальным хаpaктером распределения в геле одиннадцати сегментов вирусного генома и большой устойчивостью ротавирусной РНК к действию факторов окружающей среды. Существует несколько модификаций проведения ЭФ в ПААГ.
Незначительно отличаясь друг от друга, все они основаны на экстpaкции РНК ротавирусов, разгонке выделенных РНК в полиакриламидном геле под воздействием электрического поля и визуализации результатов разгонки РНК вирусного генома. Изменения могут быть на каждом из этих этапов проведения ЭФ в ПААГ. Так, выделение РНК ротавируса может проводиться непосредственно из фекалий, минуя стадию получения очищенного вируса возможно предварительное разделение одно- и двунитчатых РНК, введение метки 32Р, обработка исследуемого материала нуклеазой S1, разрушающей однонитчатые РНК структуры варьирует состав буферных растворов, процентное содержание разделяющего и концентрирующего геля сила тока при электрофорезе, методы окраски.
Время проведения исследования составляет 24-36 часов. В результате на полосах геля после его окраски нитратом серебра или этидиум-броми-дом выявляются профили вирусной РНК, соответствующие 11 сегментам генома вируса (Unicomb L. Е. et al., 1993 Assouli S. M. et al., 1995 Bos P. et al., 1995 Васильев Б. Я. и др., 1995 Szczepaniak Z. et al., 1996 Holmes J. H., 1996 Steele A. D. et al., 1996 Markowska-Daniel J. et al., 1996 Espinoza F. et al., 1997 Adah M. et al., 1997 Wu H. et al., 1998).
При соблюдении стандартности условий проведения электрофореза расположение сегментов генома достаточно стабильно и позволяет идентифицировать изолят на основе индивидуальности его фореграммы. Следует отметить, что хаpaктер распределения сегментов генома на фореграмме является генетически устойчивым признаком, и любые изменения в аминокислотной последовательности генома влекут за собой изменение скорости миграции вирусных белков (Kuzuya М. et al., 1996).
Более того, хаpaктер фореграммы, присущей определенному изоляту, может служить в качестве инструмента для расшифровки вспышек, выявления путей и источников заражения (Oishi J. et al., 1993 Broor S. et al., 1993 Beque R. et al., 1992). К тому же, именно этот метод позволил разделить ротавирусы на две подгруппы с так называемыми «короткими» или «длинными» фо-ретипами (обусловленными меньшей или большей подвижностью 10 и 11 сегментов генома), что имеет принципиальное значение для классификации RV популяции.
Следовательно, ЭФ в ПААГ может быть с успехом использован в диагностике, эпидемиологии, классификации и по отношению к целому ряду методик (РАЛ, ГА, выделение вируса на культуре клеток) — референс -методом.
Исследования, проведенные рядом авторских коллективов, показали, что ЭФ в ПААГ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Сравнительное изучение этих параметров применительно ЭФ в ПААГ, ПЭМ и РЛА, проведенное при обследовании 103 детей, показало, что чувствительность составляла 90, 84 и 80%, а специфичность 100, 100 и 81% (Hendricks М. К. et al., 1995).
Аналогичные данные, с привлечением помимо указанных методов еще и ПЦР и ИФА получены Buesa J. и Husain М. Правда, чувствительность ЭФ в ПААГ, по данным этих авторов, несколько уступает результатам ПЦР и ИФА, однако специфичность составляет 100% (Husain М. et al., 1995 Buesa J. et al., 1996). Подобные результаты получены и нами при исследовании фекалий от 50 больных ОКЗ методами ПЭМ, ИФА и ЭФ в ПААГ. Показатели положительных находок в ЭФ в ПААГ составили 28% против 35% в ИФА и ПЭМ.
Однако следует отметить, что в трех пробах, где ротавирусы в ПЭМ обнаружены не были, по данным ЭФ в ПААГ зафиксирована фореграмма, хаpaктерная для ротавируса (Васильев Б. Я. и др. 1990). Более поздние наши исследования, проведенные на материале 510 больных ОКЗ с использованием ИФА, ПЭМ и ЭФ в ПААГ, позволили нам подтвердить ротави-русную этиологию заболевания в 37 и 23% соответственно (Васильев Б. Я. и др.
1995).
Maldonado A. et al. (1998) при сравнительном исследовании копроматериалов детей, госпитализированных с диареей, методами ЭФ в ПААГ и ИФА документировал RV природу заболеваний в 42,7 и 49,5% соответственно.
Необходимо отметить, что помимо горизонтального применяется и вертикальный электрофорез, который, по мнению ряда авторов, сопоставим с горизонтальным по специфичности и чувствительности, но более прост. При его проведении для визуализации результата авторы предлагают включать бромистый эти-дий непосредственно в гель и использовать один и тот же гель для нескольких исследований.
Ими также было сконструировано устройство с ультрафиолетовой подсветкой, позволяющее легко и удобно читать фореграммы (Zbinden R. et al., 1992).
Модификацию вертикального электрофореза с визуализацией фореграмм методом серебрения предложили Giardano М. О. et al. (1997). Полученные ими данные показали, что новая модификация чувствительнее, специфичнее и дешевле, чем общепринятый ЭФ в ПААГ.
Таким образом, метод ЭФ в ПААГ в настоящее время нашел широкое применение в лабораториях разных стран для диагностики RV. Многочисленные сравнительные испытания этого метода с ПЭМ, ИЭМ, РАЛ и ИФА свидетельствуют о его высокой специфичности и чувствительности, а также возможности применения ЭФ в ПААГ в качестве референс-метода при изучении новых тест-систем.
Использование электрофореза в полиакриламидном геле с целью выявления источников инфекции и путей ее распространения, а также расшифровки этиологии эпидемических вспышек явилось основой для успешного решения актуальных вопросов молекулярной эпидемиологии.
Процесс переноса белков (Western-blot) или нуклеиновых кислот (Dot-blot или Northern-blot и Southern-blot) из электрофоретической матрицы и их иммобилизация на поверхности твердой фазы называется блотингом, а полученный отпечаток — блотом. При анализе блотограмм с помощью иммунных сывороток метод называют иммуноблотингом.
В качестве зондов обычно используют либо РНК, трaнcкрибированные in vitro на матрице вирусного генома, либо клоны комплементарной ДНК, полученной на матрице вирусного генома с использованием обратной трaнcкриптазы и последующим молекулярным клонированием. Ранее метку зондов осуществляли изотопами 125J или 32Р, но в последние годы применяют нерадиоактивные метки — биотин или ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.), что существенно упрощает метод, поскольку снимает вопросы изотопной безопасности.
В этом случае результаты реакции фиксируются в виде цветовых пятен, образующихся под воздействием фермента на добавляемый субстрат, что свидетельствует о гибридизации зонда с РНК вируса в исследуемом материале.
adminПоэтому для достижения максимальной эффективности применения огнетушителей для тушения пожаров необходимо знать основные правила их использования...
25 04 2024 16:33:43
День ангела имени Наира: не отмечается, поскольку имя Наира не включено в список католических и православных праздниковЗодиак имени Наира: Стрелец, РыбыХаpaктеристика имени НаираХаpaктер имени Наира : В нумерологии значение имени Наира хаpaктеризуется числом 9, которое требует от своей подопечной преданности талантам и способностям, которыми ее наградила природа...
24 04 2024 0:40:21
По окончании времени действия пребывание становится незаконным, что чревато штрафами и выдворением...
22 04 2024 18:27:20
Нами были рассмотрены аспекты лечения депрессии при помощи лекарственных препаратов, виды депрессивных состояний, а также соматизированную депрессию...
21 04 2024 8:48:13
Более 180 лет старинный монастырь существует в Красном Селе...
20 04 2024 6:51:13
Добро пожаловать в нашу гeймерскую банду...
19 04 2024 12:22:33
Именно приготовление различных блюд может не только порадовать домашних различными кулинарными изысками, но и исследовать различные культуры с помощью кухонь всего мира...
18 04 2024 23:39:24
Опытные экскурсоводы проведут вас таинственными лабиринтами...
17 04 2024 14:10:13
Тогда здесь стояли непроходимые леса, перемещающиеся дубравами и березняками...
16 04 2024 18:48:42
Более того, в России это целая система, занимающаяся оздоровления организма и снижением лишних килограмм, под названием «флетчеризм»...
15 04 2024 20:48:32
Все думаю слышали и знают, про пенсионную реформу...
14 04 2024 14:46:25
3EВ небольшом районном центре Борисоглебское под Ростовом стоит старый Борисоглебский монастырь...
13 04 2024 3:25:11
Но именно у фотографов есть особая возможность наблюдать за парой в фокусе объектива в течение многих часов...
12 04 2024 22:38:57
Чтобы не повторять эти ошибки из года в год, постарайтесь в этом году придумать несколько другой сценарий, продумать все детали торжества, и тогда вы хорошо развлечетесь в эту новогоднюю ночь...
11 04 2024 22:44:44
И реально, на территории России живут замечательные мужчины: умные, воинственные, сильные, красивые, настоящие защитники Отечества… Именно поэтому поздравлять их с этим праздником нужно необычно и красиво...
10 04 2024 12:12:49
В туристической палатке не испытываешь чувства уютной защищённости дома, а в городской квартире не ощущаешь открытости казахстанских просторов...
07 04 2024 23:52:36
Узнаем, какова стоимость патента для ИП на 2020 год для тех или иных видов деятельности — от чего зависит цена патента в России...
05 04 2024 6:19:23
Владельцы новостроек — инвесторы, ждут покупателя на квартиру, и не платят за её содержание...
04 04 2024 11:42:24
ru выбрал 8 самых интересных психологических типов, которые помогут разобраться в себе и немного лучше понимать других людей...
03 04 2024 21:48:16
ru делится гениальными хитростями, которые помогут вам навести идеальную чистоту...
02 04 2024 13:34:44
А название этой даты исполнено символики, ведь криптон символизирует собой чистый свет...
01 04 2024 5:36:18
Содержание статьи:Симптомы и диагностикаКонъюнктивит имеет ярко выраженные симптомы, по которым родители легко могут его распознать и вовремя принять меры...
31 03 2024 0:17:41
Тем не менее, в одиночных путешествиях есть свои преимущества...
30 03 2024 0:42:54
Собственно, упражнение всего одно: сложите губы так, как будто выразительно, с напряжением произносите звук «О»...
29 03 2024 15:36:14
Немалое значение на восприятие конкретной ситуации оказывает хаpaктер, темперамент, а также сила и глубина чувств...
28 03 2024 23:47:13
Состоятельные граждане нашей страны все более часто приобретают недвижимость на Кипре для использования в качестве «дачи»...
27 03 2024 15:25:18
А представьте тот момент, когда женщина понимает, что они не пришли...
26 03 2024 13:33:59
Запасаемся попкорном заранее, потому что от экрана вам будет просто не оторваться...
25 03 2024 9:22:55
Что случается в такие моменты? Конечно же, человек перегорает...
24 03 2024 10:58:51
Препарат изобилует большим количеством микроэлементов, которые укрепляют внутренний барьер, помогающий организму противостоять атакам вредоносных микроорганизмов...
22 03 2024 5:24:48
9EОдин из самых элитных и прекрасных стадионов в мире находится в украинском городе Донецке: он был построен всего за три года, и потребовал от владельца футбольного клуба «Шахтер» Рината Ахметова немалых финансовых затрат...
21 03 2024 16:12:14
А вот если лишь планируете начать заpaбатывать, придётся достаточно сложно...
20 03 2024 18:26:51
Однако, вы не расстроитесь сильно, когда ваша карьера начнёт подыматься вверх просто с астрономическими скоростями...
19 03 2024 21:47:17
Сначала в ротовую полость попадают различные бактерии, вирусы, грибы, пищевые продукты и начинают оседать на её стенках...
18 03 2024 13:21:42
К чему снится Выступление: толкование по 100 авторамК чему увидеть Выступление во снеВыступление, к которому вы не готовы – Есть несколько вариантов: экзамен по предмету, который вы не выучили, демонстрация неизвестного вам объекта или выступление на сцене, когда вы не знаете своих слов...
17 03 2024 21:40:37
В большинстве случаев после родов все приходит в норму, так как изменяется гормональный фон...
16 03 2024 23:58:17
Для Москвы городская парковка определяется в п...
15 03 2024 12:52:31
ru собрал для вас неочевидные примеры того, как реальные места попадали на логотипы брендов...
14 03 2024 10:57:48
Для этого они обращаются в территориальные отделения Федеральной Миграционной Службы, или ФМС...
13 03 2024 10:56:43
Мною было уже писано нечто о том, как я из балерины перевоплотилась в… не знаю, как это назвать, но не беда, повторю, дабы ежели кто в неведении пребывает, нить повести моей не потерял...
12 03 2024 13:39:43
Из своего тут почти все основные продукты питания: хлеб, молоко, крупы, рыба, мясо, фрукты, овощи и т...
11 03 2024 18:15:58
7EСчитается, что в Ярославль приезжают для того, чтобы увидеть старинные церкви и монастыри...
10 03 2024 22:37:51
Список документов для получения ипотеки молодой семьейБанковское учреждение нуждается в определенном пакете документов, позволяющих достоверно изучить личность клиента и удостовериться в его платежеспособности...
08 03 2024 18:37:18
ru делится с вами советами, которые подскажут, как правильно подчеркнуть красоту глаз...
07 03 2024 11:58:25
Еще:
законы -1 :: законы -2 :: законы -3 :: законы -4 :: законы -5 :: законы -6 :: законы -7 :: законы -8 :: законы -9 :: законы -10 :: законы -11 :: законы -12 :: законы -13 :: законы -14 :: законы -15 :: законы -16 :: законы -17 :: законы -18 :: законы -19 :: законы -20 :: законы -21 :: законы -22 :: законы -23 :: законы -24 :: законы -25 :: законы -26 :: законы -27 :: законы -28 :: законы -29 :: законы -30 :: законы -31 :: законы -32 :: законы -33 :: законы -34 :: законы -35 :: законы -36 :: законы -37 ::