Вирусологические исследования
Реакция коагглютинации (РКОА) основана на способности белка А золотистого стафилококка (штамм Cowan 1) соединяться с Fc-фрагментами lg человека. При этом Fab-фрагменты остаются свободными для реакции с гомологичными антигенами.
Основываясь на этом принципе, Мазанкова Л. Н. и Косоротико-ва А. И. внедрили в пpaктику тест твердофазной коагглютинации для индикации ротавирусного антигена в фекалиях больных. В качестве диагностикума использовали микробные клетки стафилококка, обработанные гипериммунной сывороткой против ротавируса обезьян (SA 11). Титр антигена определяли по наибольшему разведению, вызывающему коагглютинацию бактерий, покрытых антителами (на ++) на твердой фазе лунок панелей из полистирола.
Авторы установили специфичность теста при обследовании 410 детей в возрасте от 1 месяца до 14 лет, из которых у 84 (21%) идентифицирована ротавирусная инфекция (Мазанкова Л. Н., Косоротикова А. И., 1989).
Применение РКОА параллельно с ИФА и РАЛ показало близкую корреляцию результатов использованных методов (Zhang Y. et al., 1989 Pereira V. et al., 1992 Jap K. et al., 1992). Однако имеются сведения о появлении неспецифических реакций с копроматериалами, которые можно устранить предварительной адсорбцией взвесью стафилококков.
В то же время, несмотря на совпадение результатов обследования материалов РКОА и ИФА, чувствительность ее и специфичность оказалась ниже, чем у ИФА и сравнима с латекс-агглютинацией (Jap К. et al., 1992).
Таким образом, результаты применения РКОА позволяют рекомендовать ее для диагностики ротавирусной инфекции в лабораториях, где отсутствует возможность использования более чувствительных и специфичных методов. Однако апробированная в последнее время модификация РКОА и радиоиммунопреципитации с использованием белка А золотистого стафилококка позволила значительно повысить чувствительность и специфичность метода и изучить иммунологический ответ к VP2, VP6 и NSP2 в сыворотках и копроматериалах детей с RV инфекцией (Colomina I. et al., 1998).
Реакция агглютинации латекса (РАЛ) применяется в лабораторной пpaктике в связи с усилившейся в последние годы тенденцией использовать в качестве носителей антигенов и антител инертных синтетических материалов. С этой целью используют полистирольные латексы — синтетические глобулы со стандартным размером частиц около 0,8 мкм.
Более мелкие по размеру частицы (0,2-0,3 мкм) оседают в реакциях медленно и требуют ультрацентрифугации в процессе приготовления диагно-стикума, крупные же ( 1 мкм) часто дают неспецифические реакции. Частицы латекса, предварительно адсорбированные антителами (антигенами), приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологического антигена (антитела) и визуализируют специфический комплекс антиген-антитело.
С целью повышения специфичности и чувствительности метода латексные частицы могут быть сенсибилизированы иммуноглобулинами (Amer A. et al., 1990). В связи с простотой и скоростью проведения исследования, а также низкой стоимостью латекс-агглютинация используется в лабораторной пpaктике достаточно широко: Ruggeri F. et al., 1992.
В настоящее время налажен выпуск коммерческих тест-систем для латекс-агглютинации, что послужило основанием для проведения работ по сравнительной оценке их диагностической эффективности.
Обобщенные результаты оценки РЛА и других лабораторных методов обнаружили, что показатели чувствительности и специфичности РЛА по сравнению с ПЭМ, ИФА, ЭФ в ПААГ были достаточно высоки и равнялись 70-96% и 80-100% соот-ветствено (Santos N. et al., 1989 Molyneaux P. J. et al., 1989 Amer A. et al., 1990 Hendricks M. K. et al., 1995). Применение моноклональных антител еще более повышало диагностическую ценность РЛА (Dennehy Р. et al., 1988 Zbinden R. et al., 1992 Sanchez R. et al., 1993).
Наряду с коммерческими латекс-системами исследователи применяют и лабораторные тесты, которые дают сопоставимые с ними результаты (Amer A. et al., 1990).
В то же время ряд авторов указывали на то, что применение РЛА не лишено недостатков, так как дает определенное число ложных результатов. Так, при обследовании 200 больных детей методами ИФА и РЛА выявлено 11 ложнонегативных проб при показателях чувствительности и специфичности равных 86 и 95% соответственно (Amer A. et al., 1990).
Позднее другие авторы при обследовании 585 проб стула больных детей методом РЛА и ЭФ в ПААГ получили показатели чувствительности и специфичности равные 96 и 100% соответственно. При этом обнаружено 6 ложноотрицательных и 3 ложноположительных результата в отличие от ЭФ в nAAT.(Zbinden R. et al. 1992).
По данным Hendricks М. К. et al. обследование 103 детей в возрасте от 1 месяца до 5 лет методами ПЭМ, ЭФ в ПААГ и РЛА показало, что чувствительность этих методов равнялась 84, 90 и 80%, а специфичность 100, 100 и 81% соответственно. Авторы обнаружили 15% ложноположительных результатов по данным РЛА (Hendricks М. К. et al., 1995), что может быть связано при рота-вирусном гастроэнтерите с наличием крови в исследуемом материале.
В связи с этим при получении положительных реакций в РЛА с образцами, содержащими кровь, результаты следует интерпретировать с осторожностью и подтверждать другими методами (Bendall R. et al., 1991).
Таким образом, РЛА представляет собой наиболее простую диагностическую реакцию обнаружения ротавирусов. Являясь ценным методом экспресс-диагностики и обладая высокими показателями чувствительности и специфичности, этот метод, однако, не имеет никаких преимуществ перед ИФА, ПЭМ, ЭФ в ПААГ, кроме скорости проведения реакции, и нуждается в подтверждении другими методами.
Резюмируя материалы, следует отметить, что в целом осадочные тесты находят широкое применение в лабораторной диагностике ротавирусной инфекции в связи с высокой чувствительностью и скоростью получения результатов, простотой постановки и учета, а также отсутствием необходимости использования сложного оборудования и дорогостоящих реагентов.
Диагностические методы, основанные на выявлении вирус-специфических РНК. Разработка молекулярно-биологических методов в вирусологии привела к внедрению в пpaктику ряда новых диагностических тестов, основанных на выявлении вирусных РНК.
Их использование открыло возможность подхода к молекулярной эпидемиологии и позволило решить некоторые вопросы таксономии ротавирусов. Одним из первых диагностических методов этой группы стал электрофорез вирусного генома в геле.
Электрофорез вирусных РНК в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) достаточно универсален и широко распространен как в научно-исследовательских, так и пpaктических лабораториях. Благодаря своей высокой специфичности и чувствительности он позволяет решать целый комплекс проблем, связанных с ротавирусной инфекцией, и находит применение в диагностике, эпидемиологии и профилактике.
Возможность применения этого метода обусловлена уникальным хаpaктером распределения в геле одиннадцати сегментов вирусного генома и большой устойчивостью ротавирусной РНК к действию факторов окружающей среды. Существует несколько модификаций проведения ЭФ в ПААГ.
Незначительно отличаясь друг от друга, все они основаны на экстpaкции РНК ротавирусов, разгонке выделенных РНК в полиакриламидном геле под воздействием электрического поля и визуализации результатов разгонки РНК вирусного генома. Изменения могут быть на каждом из этих этапов проведения ЭФ в ПААГ. Так, выделение РНК ротавируса может проводиться непосредственно из фекалий, минуя стадию получения очищенного вируса возможно предварительное разделение одно- и двунитчатых РНК, введение метки 32Р, обработка исследуемого материала нуклеазой S1, разрушающей однонитчатые РНК структуры варьирует состав буферных растворов, процентное содержание разделяющего и концентрирующего геля сила тока при электрофорезе, методы окраски.
Время проведения исследования составляет 24-36 часов. В результате на полосах геля после его окраски нитратом серебра или этидиум-броми-дом выявляются профили вирусной РНК, соответствующие 11 сегментам генома вируса (Unicomb L. Е. et al., 1993 Assouli S. M. et al., 1995 Bos P. et al., 1995 Васильев Б. Я. и др., 1995 Szczepaniak Z. et al., 1996 Holmes J. H., 1996 Steele A. D. et al., 1996 Markowska-Daniel J. et al., 1996 Espinoza F. et al., 1997 Adah M. et al., 1997 Wu H. et al., 1998).
При соблюдении стандартности условий проведения электрофореза расположение сегментов генома достаточно стабильно и позволяет идентифицировать изолят на основе индивидуальности его фореграммы. Следует отметить, что хаpaктер распределения сегментов генома на фореграмме является генетически устойчивым признаком, и любые изменения в аминокислотной последовательности генома влекут за собой изменение скорости миграции вирусных белков (Kuzuya М. et al., 1996).
Более того, хаpaктер фореграммы, присущей определенному изоляту, может служить в качестве инструмента для расшифровки вспышек, выявления путей и источников заражения (Oishi J. et al., 1993 Broor S. et al., 1993 Beque R. et al., 1992). К тому же, именно этот метод позволил разделить ротавирусы на две подгруппы с так называемыми «короткими» или «длинными» фо-ретипами (обусловленными меньшей или большей подвижностью 10 и 11 сегментов генома), что имеет принципиальное значение для классификации RV популяции.
Следовательно, ЭФ в ПААГ может быть с успехом использован в диагностике, эпидемиологии, классификации и по отношению к целому ряду методик (РАЛ, ГА, выделение вируса на культуре клеток) — референс -методом.
Исследования, проведенные рядом авторских коллективов, показали, что ЭФ в ПААГ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Сравнительное изучение этих параметров применительно ЭФ в ПААГ, ПЭМ и РЛА, проведенное при обследовании 103 детей, показало, что чувствительность составляла 90, 84 и 80%, а специфичность 100, 100 и 81% (Hendricks М. К. et al., 1995).
Аналогичные данные, с привлечением помимо указанных методов еще и ПЦР и ИФА получены Buesa J. и Husain М. Правда, чувствительность ЭФ в ПААГ, по данным этих авторов, несколько уступает результатам ПЦР и ИФА, однако специфичность составляет 100% (Husain М. et al., 1995 Buesa J. et al., 1996). Подобные результаты получены и нами при исследовании фекалий от 50 больных ОКЗ методами ПЭМ, ИФА и ЭФ в ПААГ. Показатели положительных находок в ЭФ в ПААГ составили 28% против 35% в ИФА и ПЭМ.
Однако следует отметить, что в трех пробах, где ротавирусы в ПЭМ обнаружены не были, по данным ЭФ в ПААГ зафиксирована фореграмма, хаpaктерная для ротавируса (Васильев Б. Я. и др. 1990). Более поздние наши исследования, проведенные на материале 510 больных ОКЗ с использованием ИФА, ПЭМ и ЭФ в ПААГ, позволили нам подтвердить ротави-русную этиологию заболевания в 37 и 23% соответственно (Васильев Б. Я. и др.
1995).
Maldonado A. et al. (1998) при сравнительном исследовании копроматериалов детей, госпитализированных с диареей, методами ЭФ в ПААГ и ИФА документировал RV природу заболеваний в 42,7 и 49,5% соответственно.
Необходимо отметить, что помимо горизонтального применяется и вертикальный электрофорез, который, по мнению ряда авторов, сопоставим с горизонтальным по специфичности и чувствительности, но более прост. При его проведении для визуализации результата авторы предлагают включать бромистый эти-дий непосредственно в гель и использовать один и тот же гель для нескольких исследований.
Ими также было сконструировано устройство с ультрафиолетовой подсветкой, позволяющее легко и удобно читать фореграммы (Zbinden R. et al., 1992).
Модификацию вертикального электрофореза с визуализацией фореграмм методом серебрения предложили Giardano М. О. et al. (1997). Полученные ими данные показали, что новая модификация чувствительнее, специфичнее и дешевле, чем общепринятый ЭФ в ПААГ.
Таким образом, метод ЭФ в ПААГ в настоящее время нашел широкое применение в лабораториях разных стран для диагностики RV. Многочисленные сравнительные испытания этого метода с ПЭМ, ИЭМ, РАЛ и ИФА свидетельствуют о его высокой специфичности и чувствительности, а также возможности применения ЭФ в ПААГ в качестве референс-метода при изучении новых тест-систем.
Использование электрофореза в полиакриламидном геле с целью выявления источников инфекции и путей ее распространения, а также расшифровки этиологии эпидемических вспышек явилось основой для успешного решения актуальных вопросов молекулярной эпидемиологии.
Процесс переноса белков (Western-blot) или нуклеиновых кислот (Dot-blot или Northern-blot и Southern-blot) из электрофоретической матрицы и их иммобилизация на поверхности твердой фазы называется блотингом, а полученный отпечаток — блотом. При анализе блотограмм с помощью иммунных сывороток метод называют иммуноблотингом.
В качестве зондов обычно используют либо РНК, трaнcкрибированные in vitro на матрице вирусного генома, либо клоны комплементарной ДНК, полученной на матрице вирусного генома с использованием обратной трaнcкриптазы и последующим молекулярным клонированием. Ранее метку зондов осуществляли изотопами 125J или 32Р, но в последние годы применяют нерадиоактивные метки — биотин или ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.), что существенно упрощает метод, поскольку снимает вопросы изотопной безопасности.
В этом случае результаты реакции фиксируются в виде цветовых пятен, образующихся под воздействием фермента на добавляемый субстрат, что свидетельствует о гибридизации зонда с РНК вируса в исследуемом материале.
Разберемся с тем, существует ли новый закон и призыве в армию в 2020 году, какие законодательные новинки готовят нам депутаты Госдумы прямо сейчас...
19 04 2024 21:59:23
Что гарантирует пенсионный продукт: — только добровольное участие в системе накоплений;— полную сохранность долгосрочных пенсионных накоплений граждан со стороны государства;— регистрацию накопительных счетов граждан центральным администратором;— налоговые льготы для бизнеса и налоговые вычеты для граждан...
18 04 2024 2:24:55
Это может быть бактериальная или вирусная инфекция, поэтому настоятельно рекомендуется провести ряд обследований, выявляющих заболевания, которые передаются именно пoлoвым путём...
17 04 2024 6:50:27
Среди установленных видов компенсации находятся платежи, перечисляемые единовременно, а также каждый месяц в виде установленной суммы в соответствии с уровнем получаемого дохода...
16 04 2024 0:45:38
Когда мы смотрим на фотографии профессионалов, нам кажется, что это легко — просто выучил несколько правил построения кадра и пошел творить шедевры...
15 04 2024 11:31:36
А надо всего лишь помнить о том, что вкусы женщин и мужчин, увы, не всегда совпадают...
14 04 2024 19:33:35
0EКаменец-Подольская крепость — древний замок, один из выдающихся исторических памятников Украины, а так же один из самых знаменитых памятников фортификационного искусства Украины, признанный культурным наследием ЮНЕСКО – это всё про Каменец-Подольскую крепость, расположенную в городе Каменец-Подольский Хмельницкой области...
13 04 2024 6:27:33
Самые старые религиозные постройки появились при закладке первых улиц города, в начале XVIII века...
12 04 2024 22:47:33
ru представляет 12 историй о звездных татуировках, которые читаются взахлеб...
11 04 2024 11:41:15
К чему снится Вытират: толкование по 100 авторамЕсли спящий видит Вытирать во снеСнится вытирать или мыть деревянный пол до чистоты, до тех пор, пока он не станет белым – это сновидение является хаpaктеристикой самого спящего...
10 04 2024 14:16:41
ru приглашает на прогулку по сказочным местам России...
09 04 2024 7:44:39
Стоит заметить, что полное отсутствие шевеления плода перед родами тоже опасно...
08 04 2024 23:34:12
Но перед тем как решиться на приобретение, стоит ознакомиться с особенностями животного...
06 04 2024 11:44:49
Содержание статьи:Анализ рынкаПеред началом деятельности следует провести определенные маркетинговые исследования, которые позволят определить:• Какие производители уже существуют на рынке• Какие разновидности туалетной бумаги имеются, поскольку они могут быть экономичными или премиальными• На какую туалетную бумагу устанавливается самый высокий спрос• Какие торговые сети могут применяться для продажи готовой бумаги• Как привлечь покупателей к новому товару, поскольку продвигать его можно по торговым организациям или рекламировать для конечных потребителей...
05 04 2024 17:13:53
Кашель представляет собой защитную реакцию, с помощью которой организм отвечает на проникновение в дыхательные пути различных микробов, аллергенов или инородного тела...
04 04 2024 6:21:58
В такие моменты внутренний голос, казалось, шепчет: «Купи сейчас, сейчас дешево, завтра уже не будет», и покупатель попадает в ловушку...
03 04 2024 7:36:56
посев, посадка и пересадка любых растений, особенно овощных — тыквенных и паслёновых посадка картофеля (особенно, если это третий день после полнолуния), посев цветочных растений, высадка рассадыпрививка, окулировка, заготовка черенков для прививок, укоренение черенков, обрезка деревьев и кустарников (лучше в новолуние, 3 и 4 фазе Луны), прищипкарыхление (лучше в 3 и 4 фазе Луны), полив (лучше на растущей Луне), подкормки (возможны), особенно минеральные некорневые (органическими удобрениями и в небольших дозах — на убывающей Луне) однако не рекомендуется заливать и перекармливать растения, это может привести к развитию грибных болезней и гнилейпокос трав заготовка листьев лекарственных растений, закладка компоста...
02 04 2024 16:46:14
Даже у ближайших родственников, будь то сын, брат, жена или сват, нет права распоряжаться Вашим вкладом, пусть у них на руках будет Ваш договор, сберкнижка или паспорт...
01 04 2024 12:49:58
Освещение храма произошло в 1870 году...
31 03 2024 11:43:59
Пластик, находящийся в океане и выбрасывающийся волнами на пляжи по всему миру, убивает морских обитателей, вредит окружающей среде и может повлиять на наше здоровье...
29 03 2024 12:47:59
Фото собора: Собор в Крыму, называемый усыпальницей адмиралов, высится на Центральном холме Севастополя...
28 03 2024 2:45:25
Осложняется ситуация тем, что те препараты, которые используют обычно с целью облегчения симптомов простуды, во время ожидания малыша принимать крайне нежелательно...
26 03 2024 13:14:42
при пересадке в США всегда необходимо оформлять транзитную визу...
24 03 2024 17:25:51
Вместе с тем возникает потребность в чистке ковров, так как на них собирается пыль и грязь, а резкие трудно выводимые пятна не радуют глаз...
23 03 2024 8:20:11
К счастью, всегда можно посетить наш портал, открыв для себя специализированный календарь беременности двойней по неделям...
22 03 2024 1:48:22
21 03 2024 18:24:54
Расходы, таким образом, теоретически распределяются равномерно между всеми жильцами...
20 03 2024 17:56:12
19 03 2024 0:56:13
comПодписки можно было разделить на несколько типов, но большинство из них уже приказали долго жить:Мобильные подписки...
18 03 2024 12:27:41
Мы надеемся, что медицинская страховка вам не пригодится, но на всякий случай расскажем, как обезопасить себя за границей...
17 03 2024 13:15:38
ru предлагает вам познакомиться с удивительными природными явлениями и аномалиями, над которыми ученым приходится поломать голову...
16 03 2024 1:24:43
Чтобы с вами такого не повторилось, мы расскажем о нескольких важных правилах безопасного использования гаджетов...
15 03 2024 19:51:48
Здесь находится библиотека, музей «Артека» и «Музей космонавтики», созданный в 1967 г...
14 03 2024 22:56:15
При поиске ответов нужно учесть множество факторов, в том числе возможности и риски после переезда в другое государство...
13 03 2024 18:18:28
Лучше питайтесь чем то полезным и откройте банку огурцов или помидоров, а можете и приготовить свои чипсы, пожарив тонкие ломтики картофеля на сковороде...
12 03 2024 2:57:41
В определение животного мира тогда включили все виды живых организмов и существ, распространенных на территории России (вне зависимости от того, временно или всегда)...
11 03 2024 19:41:15
Поэтому аскариды у детей – явление нередкое...
10 03 2024 3:36:28
А если ссоры начинают переходить в хаpaктерные упреки и последующие скандалы, то лучше задуматься не только о том, как мириться с мужем, а как не создавать более причин для ссор...
09 03 2024 3:52:58
Это название абсолютно не случайно – оно весьма символично, ведь сапфир один из самых дорогих и твердых камней на Земле...
08 03 2024 1:22:50
Платья некоторых невест вошли в историю, став олицетворением женственности и элегантности...
06 03 2024 21:29:33
В первую очередь учитывается при праздновании золотой свадьбы, сколько лет прожили супруги вместе...
05 03 2024 2:16:32
Федеральный закон о поборах: официальный текстДействия руководства учебного заведения регламентирует ФЗ 273 Об образовании в РФ...
04 03 2024 22:20:24
Правда, учёные говорят, что только к 35 годам его уровень достигает той отметки, когда папа способен наслаждаться запахом младенческого тельца...
03 03 2024 0:16:51
Разумеется, для конечного обывателя есть как минусы, так и плюсы кредитования...
02 03 2024 5:32:53
Еще:
законы -1 :: законы -2 :: законы -3 :: законы -4 :: законы -5 :: законы -6 :: законы -7 :: законы -8 :: законы -9 :: законы -10 :: законы -11 :: законы -12 :: законы -13 :: законы -14 :: законы -15 :: законы -16 :: законы -17 :: законы -18 :: законы -19 :: законы -20 :: законы -21 :: законы -22 :: законы -23 :: законы -24 :: законы -25 :: законы -26 :: законы -27 :: законы -28 :: законы -29 :: законы -30 :: законы -31 :: законы -32 :: законы -33 :: законы -34 :: законы -35 :: законы -36 :: законы -37 ::